X hits on this document

Word document

НАНОТЕХНОЛОГИЯ И ВКЛЮЧЕНИЕ АТОМОВ ДЕЙТЕРИЯ 2H, УГЛЕРОДА 13C, - page 10 / 24

55 views

0 shares

0 downloads

0 comments

10 / 24

дейтерия в молекулы индивидуальных аминокислот культуральной жидкости составил 51% для молекулы лейцина/изолейцина, 58,8% для молекулы валина, в то время как уровни изотопного включения для молекулы аланина составили 77,5%, а для молекулы фенилаланина -75%.

Аналогичная корреляция наблюдается и в молекулах аминокислот белковых гидролизатов. Уровни включения атомов дейтерия 2H и углерода 13C в молекулы метаболически связанных аминокислот в пределах одинаковых концентраций меченых субстратов, обнаружили определённую коррелляцию: уровни изотопного включения для молекул валина и лейцина (семейство пирувата), фенилаланина и тирозина (семейство ароматических аминокислот) коррелировали. Уровни изотопного включения для молекул глицина и серина (семейство серина), аспарагиновой кислоты и лизина (семейство аспарагина) также имели близкие величины.

Важным результатом являются высокие уровни включения атомов стабильных изотопов 2Н и 13C в молекулы полученных аминокислот. В настоящее время исследования по изучению биотехнологического потенциала метилотрофных бактерий для направленного синтеза изотопномеченых аминокислот и других БАС продолжаются как на кафедре биотехнологии МГАТХТ им. М.В. Ломоносова, так и в ГНИИ ГЕНЕТИКА.

Генно-инженерные методы включения атомов стабильных изотопов в молекулы аминокислот и белков.

Осуществлять направленное биосинтетическое включение атомов стабильных изотопов в молекулы аминокислот и белков удобно за счёт использования векторов экспрессии нужных генов, ответственных за биосинтез того или иного интересующего исследователей белка. Оправдано и целесообразно использование для этих целей векторов экспрессии на основе плазмидной ДНК бактерии E. coli, например, вектор экспрессии Т4 лизоцима, включающий в своем составе плазмиду pHSe5 [118]. В результате использования этого вектора экспрессии, были получены миллиграммовые количества Т4-лизоцима, селективно меченного стабильными изотопами азота-15N и углерода 13C. Включение атомов стабильных изотопов в молекулы достигалось за счет роста генного конструкта E. coli на средах, содержащих [15N]- или [13C]аминокислоты. Метод также может применяться для получения индивидуальных меченых белков, экспрессия которых происходит в системах, отличных от E. coli, например, системы экспрессии на основе клеток насекомых или млекопитающих [119].

Другие микробные системы, в которых белки экспрессируются с высокими выходами, также могут быть пригодны для включения атомов стабильных изотопов в молекулы. К ним относятся такие хорошо изученные биологические объекты, как дрожжи, бактерии и бактериофаги. Так, за счёт использования вышеперечисленных микробных объектов в качестве векторов экспрессии были получены препаративные количества индивидуальных очищенных [15N]белков: нуклеаза стафилококка [120], интерлейкин 1b [121], белок репрессор фага P22C2 [122], тиредоксин E. coli [123], гемоглобин [124], a-протеаза [125], ингибитор субтилизина [126], репрессор фага l [127], и белок человеческого фактора роста N-ras P21 [128].

В работе [129] описан метод включения атомов дейтерия в молекулы индивидуальных белков с использованием вектора экспрессии на основе штамма облигатных метилотрофных бактерий Methylobacillus flagellatum. Метод состоит в том, что в метилотрофах клонируют структурный ген исследуемого белка. Таким методом можно в будущем получать, например, [2H]b-интерфероны, хорошо экспрессируемые в клетках

Document info
Document views55
Page views55
Page last viewedTue Dec 06 20:40:12 UTC 2016
Pages24
Paragraphs266
Words9831

Comments