X hits on this document

Word document

НАНОТЕХНОЛОГИЯ И ВКЛЮЧЕНИЕ АТОМОВ ДЕЙТЕРИЯ 2H, УГЛЕРОДА 13C, - page 11 / 24

48 views

0 shares

0 downloads

0 comments

11 / 24

метилотрофов, либо другие интересующие исследователей белки. Метод также позволяет вводить в молекулы аминокислот и белков другие атомы стабильных изотопов, например, изотоп углерода 13C. В связи с этим следует подчеркнуть, что основным недостатком при использовании полученных данным методом [13C]аминокислот в ЯМР-исследованиях являются всё же недостаточно высокие уровни изотопного обогащения аминокислот, что обусловливает усложнение спектров ЯМР за счет 12C- 13C-спин-спинового взаимодействия между близлежащими атомами углерода в молекуле [130]. Так как мультиквантовые резонансы близлежащих атомов углерода в молекуле являются основным препятствием для интерпретации спектров ЯМР, необходимо применять усовершенствованные методы включения атома изотопа углерода 13C в молекулы аминокислот, позволяющие лимитировать процесс разбавления изотопной метки. Так, в последнее время были генетически сконструированы новые штаммы бактерий, которые несут мутации по генам метаболизма определенного круга предшественников этих аминокислот [131]. Это позволяет избежать разбавления изотопной метки при росте микроорганизма на среде, содержащей те или иные меченые субстраты за счет ингибирования биосинтеза аминокислот de novo у данных мутантных штаммов бактерий.

При выборе определенных мутаций по генам метаболизма стремятся удовлетворить как миниум двум условиям для нормального функционирования подобных генетически сконструированных систем, чтобы, во-первых, по возможности снизить деградацию изотопной метки или ее разбавление в процессе внутриклеточного синтеза немеченых предшественников de novo и во-вторых, свести к минимуму процессы перестройки меченых положений углеродного скелета молекулы за счет биосинтеза одинаковых интермедиантов, образующихся по сопряжённым путям биосинтеза. Данная стратегия реализована в работе [132], где сообщается о получении двух генетически сконструированных штаммов бактерий, обозначенных как E. coli DL10 и E. coli DL11, которые несли геномные делеции, исключающие обмен атомов углерода между интермедиаторами в процессе гликолиза и в цикле трикарбоновых кислот.

За счёт использования генетически сконструированных штаммов удалось включить атомы изотопа углерода 13C в молекулы аминокислот с уровнями изотопного обогащения до 95%. Ферменты у штамма E. coli DL10 были инактивированы за счёт мутаций, вследствие чего он ассимилировал в качестве источников углерода и энергии сукцинат и ацетат из ростовой среды, а [1-13C]лактат добавляли в ростовую среду для компенсации метаболических потребностей клетки и для введения атомов изотопа углерода 13C в молекулы аминокислот, синтезируемых в процессе гликолиза.

Другой штамм бактерий E. coli DL11 мог утилизировать немеченую глюкозу в качестве источников углерода и энергии по гликолитическому пути ассимиляции углерода, в то время как [1,4-13C]cукцинат и [1-13C]ацетат добавляли в ростовую среду для того, чтобы стимулировать биосинтез [13C]аминокислот, образующихся по циклу трикарбоновых кислот. Кроме того, в этом случае было необходимо ввести в бактериальный геном дополнительную мутацию, связанную c геном a-кетоглутаратдегидрогеназы, чтобы минимизировать процесс деградации метки в цикле трикарбоновых кислот.

Выделение изотопномеченых молекул аминокислот из белковых гидролизатов микроорганизмов.

Биомасса микроорганизмов, выращенных на средах, содержащих стабильные изотопы, является ценным источником различных изотопномеченых БАС, в том числе аминокислот. При этом наиболее распространённым и традиционным методом

Document info
Document views48
Page views48
Page last viewedSun Dec 04 19:47:54 UTC 2016
Pages24
Paragraphs266
Words9831

Comments