X hits on this document

Word document

НАНОТЕХНОЛОГИЯ И ВКЛЮЧЕНИЕ АТОМОВ ДЕЙТЕРИЯ 2H, УГЛЕРОДА 13C, - page 6 / 24

46 views

0 shares

0 downloads

0 comments

6 / 24

биосинтезу на средах содержащих максимальные концентрации тяжелой воды [73], в то время как клетки высших растений способны выдерживать не более 60% тяжёлой воды [74], а животные клетки не более 30% [75].

С точки зрения физиологии и генетики адаптация клетки к тяжёлой воде является комплексным феноменом и может привести к изменениям активностей ферментативных реакций, что сказывается косвенно на структуре и функциях молекул синтезируемых БАС, процессах биосинтеза и метаболизма и даже морфологии клетки. В связи с этим, разработка методов физиологической адаптации клетки к тяжёлой воде для получения высокообогащённых дейтерием молекул БАС является весьма актуальной задачей [76-78].

При адаптации биологических объектов к тяжёлой воде учитываются химические изотопные эффекты, которые для изотопных пар протий/дейтерий могут быть аномально высокими [79]. Различают первичные и вторичные изотопные эффекты. К первичным изотопным эффектам следует отнести изменение констант скоростей химических реакций, протекающих в тяжёлой воде по отношению к таковым в обычной воде, измеренных как соотношение kh /k2h. Это соотношение меняется для различных связей, образованных с участием дейтерия и может варьировать в пределах от 7 до 10 единиц. К вторичным изотопным эффектам относятся изменения в констатнах скоростей химических реакций, обусловленных действием 2Н2О как растворителя (большая струрированность и вязкость, плотность, коэффициент диффузии и т. п.).

Тяжёлая вода является гидроскопическим соединением, активно поглощающем пары влаги из воздуха, неорганических солей среды, при стерилизации и т. п., и, следовательно, этапы, связанные с выращиванием бактерий на тяжёловодородных средах необходимо проводить в герметических условиях с использованием безводных реагентов, предварительно перекристаллизованных в тяжёлой воде неорганических солей и т. п.

Атомы изотопа кислорода 18O можно включать в молекулы аминокислот за счёт выращивания микроорганизмов на средах, содержащих другой изотопный аналог воды - Н218O воду. Адаптация клеток к Н218O не является лимитирующим этапом. Однако, Н218O используется в качестве источника изотопной метки в редких случаях, вследствие высокой стоимости изотопных соединений кислорода [80].

Селективного включения атомов стабильных изотопов в определённые положения молекул аминокислот и белков достигается за счёт применения комбинации меченых и немеченых субстратов в ростовых средах [81], меченых предшественников аминокислот [82], или при использовании ауксотрофных по определённым аминокислотам штаммов микроорганизмов [83]. Для этих целей очень хорошо подходит такая распространённая бактерия как E. coli, биосинтез аминокислот в которой к настоящему времени изучен наиболее детально и для которой получен многочисленный набор мутантных форм [84].

Очень часто, разветвлённые пути метаболизма меченых аминокислот в клетке приводят к специфическому мечению других биосинтетически родственных молекул аминокислот за счёт использования клеткой многочисленных минорных путей биосинтеза и сопряжённых реакций метаболизма. В некоторых случаях этот фактор может существенно облегчить процесс включения атомов стабильных изотопов в молекулы селективно меченых белков и аминокислот. Так был получен [15N]Т4-лизоцим, с селективным характером включения атомов 15N лишь по остаткам глутамата, глутамина и аргинина в молекуле [85]. В работах [86, 87] сообщается о получении других индивидуальных [15N]белков, селективно меченных изотопом 15N по остаткам гистидина и лизина.

Document info
Document views46
Page views46
Page last viewedSun Dec 04 10:16:19 UTC 2016
Pages24
Paragraphs266
Words9831

Comments