X hits on this document

Word document

НАНОТЕХНОЛОГИЯ И ВКЛЮЧЕНИЕ АТОМОВ ДЕЙТЕРИЯ 2H, УГЛЕРОДА 13C, - page 9 / 24

58 views

0 shares

0 downloads

0 comments

9 / 24

в настоящее время все возрастает благодаря разработке новых технологий химического синтеза метанола [102]. Эти бактерии привлекают внимание исследователей прежде всего как дешевые источники микробного белка и аминокислот [103, 104]. Знание путей бактериального метаболизма позволяет осуществлять направленное введение атомов стабильных изотопов в молекулы аминокислот.

Метилотрофные бактерии окисляют метанол с использованием фермента - метанолдегидрогеназы, последующие окислительные реакции катализируют формальдегид- и формиатдегидрогеназа [105-108]. Лишь затем продукт окисления метанола в виде формальдегида фиксируется клеткой одним из двух путей ассимиляции углерода: рибулозо-5-монофосфатным и сериновым [109, 110].

Мы начали эффективно использовать ауксотрофные штаммы метилотрофных бактерий для включения атомов стабильных изотопов дейтерия 2H и углерода 13C в молекулы аминокислот ещё 10 лет тому назад, работая в группе академика РАМН В.И. Швеца на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова. Для этих целей мы использовали биологическую конверсию дешёвых низкомолекулярных меченых субстратов - (13C)метанола, (2Н)метанола и тяжёлой воды 2H2O в клетках метилотрофов в молекулы дорогостоящих меченых БАС [111-113]. Традиционным подходом при этом было выращивание соответствующих штаммов-продуцентов аминокислот, устойчивых к росту на средах, содержащих стабильные изотопы водорода, углерода, азота и др. В работах [114, 115] сообщается о включение атомов изотопа углерода 13C в молекулы аминокислот (уровни включения стабильных изотопов в молекулах варьируют от 30% для L-[13C]лейцина до 90% для L-[13C]фенилаланина) за счёт использования ауксотрофных по L-изолейцину бактерий Methylobacillus flagellatum.

Наши исследования показали, что [13C]метанол в отличие от тяжёлой воды не оказывает существенного биостатического эффекта на ростовые и биосинтетические характеристики метилотрофов [116], поэтому данный подход можно эффективно использовать для введения в молекулы синтезируемых БАС двойной изотопной метки (например, введение изотопа углерода 13C в молекулы на фоне максимальных концентраций тяжёлой воды в ростовых средах). В работе [117] нами были получены [2H]- и [13C]аминокислоты с разными уровнями изотопной обогащённости при росте ауксотрофного по L-лейцину штамма факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum и ауксотрофного по L-изолейцину штамма облигатных метилотрофных бактерий Methylobacillus flagellatum на минимальных средах с (13C)метанолом, (2Н)метанолом и тяжёлой водой 2H2O . [13C]- и [2Н]аминокислоты разного уровня изотопной замещённости выделяли как из культуральных жидкостей, полученных после выращивания бактерий на средах с соответствующими изотопномечеными субстратами, так из гидролизатов белков биомассы.

Биосинтетически полученные нами молекулы [2H]- и [13С]аминокислот представляли собой смеси, в которых присутствовали изотопнозамещённые формы молекул, различающиеся количеством атомов водорода и углерода, замещённых на дейтерий 2H и изотоп углерода 13C. При этом распределение зависело как от общего включения изотопа в молекулу, так и от способа их получения. Наши исследования показали, что в условиях ауксотрофности по лейцину уровень изотопного обогащения молекулы лейцина, а также метаболически связанных с ним молекул аминокислот немного ниже, чем для других молекул аминокислот, вероятно, за счёт сохранения минорных путей метаболизма, связанных с биосинтезом данных аминокислот de novo. При выращивании B. methylicum на среде, содержащей 98% тяжёлую воду 2H2O и немеченый L-лейцин, уровни включения

Document info
Document views58
Page views58
Page last viewedThu Dec 08 08:24:24 UTC 2016
Pages24
Paragraphs266
Words9831

Comments