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Le Bulletin des BioTechnologies – Mai 2005 – n°228

sensible aux trèsfaibles tensions d'oxygène et ArcA/B fonctionnant en microaérobiose.

L'inactivationde pflA, pta et ppc permet une surproduction de lactate sur glucose. La production de lactateest donc favorisée par l'inactivation de pflA et la surproduction résultante de lactatedéshydrogénase. Le flux  dans la voie Pta–Ack (acétate kinase) et la production d'éthanol sontlimités par la disponibilitéd'acétyl coenzyme A. Parcontre, le flux de la glycolyse est stimulé par l'inactivation de pykF.

En oxygène limitant,la chaîne respiratoire est bloquée. L'ATP disponible ne provient que de laglycolyse et la réaction permise par l'acétate kinase (Ack) qui va donner de l'acétylphosphate. Il n'estpas étonnant que, pour satisfaire ce besoin important, le flux de la glycolysesoit accéléré autant que possible. Les réactions impliquant pyruvatekinase (Pyk) et Acksont stimulées pour recharger l'ATP.

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59. Des chercheurs deRice University ont optimisé la production aérobie de succinate chezEscherichia coli en stimulant le court-circuit

glyoxylique (clivant l'isocitrate en glyoxylate et succinate), en inactivant les gènes sdhAB de succinodéshydrogénase(donnant normalement du fumarate dans le cycle de Krebs), icd(de l'isocitrate déshydrogénase donnantl'oxalosuccinate), iclR (répresseur de l'opéron acétate),poxB (codant la pyruvate oxydase) et (ackA-pta); H Lin et al.;  Biotechnology & Bioengineering 20(JUN05) 775-779. Ils ont ensuite complété leur intervention par une action sur  la partie oxydative du cycle tricarboxylique de Krebs. H Lin et al.; Metabolic Engineering 7 (MAR05)116-127, et AM Sanchez etal.; Biotechnology Progress 21 (MAR-APR05) 358-365 qui ont stimulé la voie anaplérotique réalimentant lecycle de Krebs en oxaloacétate encondensant pyruvate et CO2grâce à la pyruvate carboxylase, après avoir inactivé l'alcool déshydrogénase empêchant ainsi la formation d'éthanol, et la lactate déshydrogénase pour empêcher celle du lactate.

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Les Protéines et les Enzymes

60. L'isomaltulose (ou palatinose, -D-glucopyranosyl-1,6-D-fructofuranose)est un isomère du saccharose (-D-glucopyranosyl-1,2-D-fructofuranose) qu'on apprécie comme un sucre neprovoquant pas de caries. Il est, par ailleurs, plus difficilement digestibleque le saccharose, ce qui peut en faire un sucre pour diabétiques. Du fait quec'est un disaccharide réducteur,contrairement au saccharose, on peut s'en servir comme précurseur dans la productionde sucres alcools également édulcorantset de biosurfactants et biopolymères. On le produit grâce à des sucroseisomérases (alias sucrose mutases ou isomaltulose synthases).

Des sucrose isomérases ontété purifiées à partir d'Erwinia rhapontici, Protaminobacter rubrum, Serratia plymuthica  (avec des brevets de Sudzucker AGcouvrant l'utilisation des trois), Agrobacterium radiobacter, Pseudomonas mesoacidophila MX-45, Klebsiella sp.

On a, usuellement, en sus de l'isomaltulose,une productionen proportions variables de son isomère le tréhalulose (-D-glucopyranosyl-1,1-D-fructose) ainsi que de glucose et fructose dont n'a quefaire par une réaction réverse. Selon l'enzyme on a surtout de l'isomaltulose(75 à 85%) ou du tréhalulose (90%). De plus, selon les conditions de conversion(température et pH), on a une fluctuationdes produits, avec productions depetites quantités d'isomaltose et isomélezitose. Non seulement ces sous-produits diminuent le rendement, maisentraînent des étapes de purificationdont on se passerait bien. Enfin la réaction est lente, et ne fonctionne quedans des conditions opérationnelles très étroites. Ilfaudrait améliorer sérieusement ces caractéristiques ce à quoi se sont attaquédes chercheurs australiens de Brisbane. L Wu et al.; Applied &Environmental Microbiology 71 (MAR05) 1581-1590 qui utilise une enzyme d'une Pantoea dispersa locale après avoir étudié plusieurs autres bactériespotentiellement intéressantes et quatre des enzymes les plus prometteuses. Elledonne la plus forte efficacité de production d'isomaltulose (au moins

chez Escherichiacoli) et pratiquement pas de réaction réverse.

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61. Chez Escherichia coli, une enzyme périplasmique, DsbA, permet la formationdes ponts disulfures assurant la conformationfinale des enzymes sécrétées. Mais cette formation est assez inefficace. De ce fait,des protéines eucaryotiques recombinantes ne présentant pasdeux ponts disulfures consécutifsexigent la fonction d'une autre enzyme, la disulfure isomérase DsbC.

M Berkmenet al.; Journal of Biological Chemistry 280 (25MAR05) 11387-11394 montrent que, pour la phytase acide AppA autochtone d'E.coli qui possède trois ponts disulfures consécutifs et un nonconsécutif, DsbC est également nécessaire à l'acquisition de la conformation normale. Ils ont déplacé ces ponts etconstaté que DsbC est nécessaire pourles ponts disulfures séparés desautres. Ceci indique que les pontsdisulfures se forment au cours de la translocation à travers la membrane plasmique.

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62. La xylitol déshydrogénase NAD+-dépendante (XDH) de Pichiastipitis est l'une des enzymes clés dans la productiond'éthanol à partir du xylose. Des chercheurs de Kyoto ont, dans le cadre d'uneamélioration générale du système de conversion, modifié l'enzyme dans deuxdomaines : le changement de co-facteur (NAD+ en NADP+) et sa stabilisation par introduction d'un atome de zinc supplémentaire. Cette dernière modification a été nécessitée par lamoindre thermostabilité des enzymes mutante satisfaisant à la premièrecondition. S Watanabe et al.; Journal of Biological Chemistry 280(18MAR05) 10340-10349.

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63. La prédiction des fonctions de gènes repose,actuellement, surtout sur des comparaisons de séquences. Mais il arriveque ces prédictions soient faussées, car l'évolution a fait divergerles fonctions, et on connaît denombreux exemples le démontrant.

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